雌激素受体结构专利检索-激素生物化学专利检索查询-专利查询网 (2024)

17β-雌二醇(E2)是调节多种生物过程的甾体类激素。E2的许多生理作 用都是由雌激素受体(ER)，例如雌激素受体α和雌激素受体β介导。E2 与雌激素受体之间的相互作用能导致受体活化。从而使雌激素受体从胞浆 转运至细胞核内，在核内雌激素受体可起到如转录激活物的作用。
E2通过与雌激素受体α(ERα)的相互作用调节不同组织，包括生殖组 织的分化和维持。E2还能够以雌激素受体依赖的方式抑制IL-1β诱导的 NFκB报道子活性和IL-6表达。这一活性与E2在体内的抗炎活性有关。
发明概述
一方面，本发明描述了结晶多肽-配体复合体，其包括雌激素受体多 肽和具有稠合环系(ringsystem)的配体。所述稠合环系包括至少两个稠合 环，至少其中之一包括至少一个氮。
另一方面，本发明描述结晶多肽-配体复合体，其包括雌激素受体多 肽和具有稠合环系的配体，所述稠合环系包括至少两个稠合环，至少其中 之一包括至少两个杂原子。
另一方面，本发明描述了结晶多肽-配体复合体，其包括雌激素受体 多肽和具有稠合环系的配体。该配体抑制NFκB转录活性并且不刺激小鼠 或人的子宫组织的增殖。
另一方面，本发明描述了包括晶体的组合物。该晶体包括雌激素受体 多肽和具有稠合环系的配体，所述稠合环系包括至少两个稠合环，至少其 中之一包括至少一个氮。
另一方面，本发明描述了包括晶体的组合物，其包括雌激素受体多肽 和具有稠合环系的配体。所述稠合环系包括至少两个稠合环，至少其中之 一包括至少两个杂原子。
另一方面，本发明描述了包括晶体的组合物，其包括雌激素受体多肽 和具有稠合环系的配体。该配体抑制NFκB转录活性并且不刺激小鼠或人 的子宫组织的增殖。
另一方面，本发明描述了包括利用复合体的三维模型来设计与雌激素 受体多肽相互作用的物质的方法。该复合体包括与配体结合的雌激素受体 多肽，并且结合雌激素受体多肽的配体具有包括至少两个稠合环的稠合环 系。至少两个稠合环的至少一个包括至少一个氮。
另一方面，本发明描述了包括利用复合体的三维模型来设计与雌激素 受体多肽相互作用的物质的方法。该复合体包括与配体结合的雌激素受体 多肽，并且结合雌激素受体多肽的配体具有包括至少两个稠合环的稠合环 系。至少两个稠合环的至少一个包括至少两个杂原子。
另一方面，本发明描述了包括利用复合体的三维模型来设计与雌激素 受体多肽相互作用的物质的方法。该复合体包括与配体结合的雌激素受体 多肽，并且结合雌激素受体多肽的配体抑制NFκB转录活性并且不刺激小 鼠或人的子宫组织的增殖。
另一方面，本发明描述了包括利用雌激素受体多肽的三维模型来设计 与雌激素受体多肽相互作用的物质的方法。
另一方面，本发明描述了包括利用晶体复合体的三维结构实施合理的 药物设计来选择物质的方法，所述晶体复合体包括雌激素受体多肽。该方 法包括将该物质与雌激素受体多肽接触并检测该物质结合雌激素受体多肽 的能力。
另一方面，本发明描述了包括将雌激素受体多肽与配体接触以形成组 合物并且结晶该组合物以形成晶体复合物(其中配体结合雌激素受体多肽) 的方法。该配体具有包括至少两个稠合环的稠合环系，至少其中之一包括 至少一个氮。该晶体复合物衍射X射线至分辨率至少为约3.5。
另一方面，本发明描述了包括将雌激素受体多肽与配体接触以形成组 合物并且结晶该组合物以形成晶体复合物(其中配体结合至雌激素受体多 肽)的方法。该配体具有包括至少两个稠合环的稠合环系，至少其中之一包 括至少两个杂原子。该晶体复合物衍射X射线至分辨率至少为约3.5。
另一方面，本发明描述了包括将雌激素受体多肽与配体接触以形成组 合物并且结晶该组合物以形成晶体复合物(其中配体结合至雌激素受体多 肽)的方法。该配体抑制NFκB转录活性并且不刺激小鼠或人的子宫组织的 增殖。该晶体复合物衍射X射线至分辨率至少为约3.5。
另一方面，本发明描述了软件系统，该软件系统包含指令，以使计算 机系统接受有关配体结合的雌激素受体多肽的结构信息，以及有关候选物 质的信息。计算机系统从这一信息能够确定候选物质对雌激素受体多肽的 结合特征。结合雌激素受体多肽的配体具有包括至少两个稠合环的稠合环 系，至少其中之一包括至少一个氮。
另一方面，本发明描述了软件系统，该软件系统包含指令，以使计算 机系统接受有关配体结合的雌激素受体多肽的结构信息，以及有关候选物 质的信息。计算机系统从这一信息能够确定候选物质对雌激素受体多肽的 结合特征。结合雌激素受体多肽的配体具有包括至少两个稠合环的稠合环 系，至少其中之一具有至少两个杂原子。
另一方面，本发明描述了软件系统，该软件系统包含指令，以使计算 机系统接受有关配体结合的雌激素受体多肽的结构信息，以及有关候选物 质的信息。计算机系统从这一信息能够确定候选物质对雌激素受体多肽的 结合特征。结合雌激素受体多肽的配体抑制NFκB转录活性并且不刺激小 鼠或人的子宫组织的增殖。
另一方面，本发明描述了位于存储了大量指令的计算机可读介质上的 计算机程序。当由一个或多个处理器执行时，该一个或多个处理器接受有 关包括结合配体的雌激素受体多肽复合体的结构信息以及有关候选物质的 信息。从这一信息该一个或多个处理器确定候选物质对雌激素受体多肽的 结合特征。结合雌激素受体多肽的配体具有包括至少两个稠合环的稠合环 系，至少其中之一包括至少一个氮。
另一方面，本发明描述了位于存储了大量指令的计算机可读介质上的 计算机程序。当由一个或多个处理器执行时，该一个或多个处理器接受有 关包括结合配体的雌激素受体多肽复合体的结构信息以及有关候选物质的 信息。从这一信息该一个或多个处理器确定候选物质对雌激素受体多肽的 结合特征。结合雌激素受体多肽的配体具有包括至少两个稠合环的稠合环 系，至少其中之一具有至少两个杂原子。
另一方面，本发明描述了位于存储了大量指令的计算机可读介质上的 计算机程序。当由一个或多个处理器执行时，该一个或多个处理器接受有 关包括结合配体的雌激素受体多肽复合体的结构信息以及有关候选物质的 信息。从这一信息该一个或多个处理器确定候选物质对雌激素受体多肽的 结合特征。结合雌激素受体多肽的配体抑制NFκB转录活性并且不刺激小 鼠或人的子宫组织的增殖。
另一方面，本发明描述了包括接受有关复合体的结构信息和建立ERα 多肽与候选物质的结合特征模型的方法，所述复合体包括结合配体的雌激 素受体多肽。与雌激素受体多肽结合的该配体具有包括至少两个稠合环的 稠合环系，至少其中之一包括至少一个氮。通过软件系统执行该方法。
另一方面，本发明描述了包括接受有关复合体的结构信息和建立ERα 多肽与候选物质的结合特征模型的方法，所述复合体包括结合配体的雌激 素受体多肽。与雌激素受体多肽结合的该配体具有包括至少两个稠合环的 稠合环系，至少其中之一包括至少两个杂原子。通过软件系统执行该方法。
另一方面，本发明描述了包括接受有关复合体的结构信息和建立ERα 多肽与候选物质的结合特征模型的方法，所述复合体包括结合配体的雌激 素受体多肽。结合雌激素受体多肽的配体抑制NFκB转录活性并且不刺激 小鼠或人的子宫组织的增殖。通过软件系统执行该方法。
另一方面，本发明描述了位于存储了大量指令的计算机可读介质上的 计算机程序。当由一个或多个处理器执行该指令时，该一个或多个处理器 将接受有关包括结合配体的雌激素受体多肽的复合体结构信息并且建立雌 激素受体多肽与候选物质的结合特征模型。与雌激素受体多肽结合的该配 体具有包括至少两个稠合环的稠合环系，至少其中之一包括至少一个氮。
另一方面，本发明描述了位于存储了大量指令的计算机可读介质上的 计算机程序。当由一个或多个处理器执行该指令时，该一个或多个处理器 将有关包括结合配体的雌激素受体多肽的复合体结构信息并且建立雌激素 受体多肽与候选物质的结合特征模型。与雌激素受体多肽结合的该配体具 有包括至少两个稠合环的稠合环系，至少其中之一包括至少两个杂原子。
另一方面，本发明描述了位于存储了大量指令的计算机可读介质上的 计算机程序。当由一个或多个处理器执行该指令时，该一个或多个处理器 将有关包括结合配体的雌激素受体多肽的复合体结构信息并且建立雌激素 受体多肽与候选物质的结合特征的模型。结合雌激素受体多肽的配体抑制 NFκB转录活性并且不刺激小鼠或人的子宫组织的增殖。
另一方面，本发明描述了包括指令的软件系统，该指令用于使计算机 系统接受有关包括结合配体的雌激素受体多肽的复合体结构信息并且建立 雌激素受体多肽与候选物质的结合特征的模型。与雌激素受体多肽结合的 该配体具有包括至少两个稠合环的稠合环系，至少其中之一包括至少一个 氮。
另一方面，本发明描述了包括指令的软件系统，该指令用于使计算机 系统接受有关包括结合配体的雌激素受体多肽的复合体结构信息并且建立 雌激素受体多肽与候选物质的结合特征的模型。与雌激素受体多肽结合的 该配体具有包括至少两个稠合环的稠合环系，至少其中之一包括至少两个 杂原子。
另一方面，本发明描述了包含指令的软件系统，该指令用于使计算机 系统接受有关包括结合配体的雌激素受体多肽的复合体结构信息并且建立 雌激素受体多肽与候选物质的结合特征的模型。结合雌激素受体多肽的配 体抑制NFκB转录活性并且不刺激小鼠或人的子宫组织的增殖。
另一方面，本发明描述了在受试者中调节ERα活性的方法。该方法包 括使用合理的药物设计以选择能够调节ERα活性的物质并且向受试者施 用治疗有效量的该物质。
另一方面，本发明描述了治疗具有ERα活性相关病症的受试者的方 法。该方法包括使用合理的药物设计以选择能够影响ERα活性的物质并且 向需要的受试者施用治疗有效量的该物质。
另一方面，本发明描述了预防性治疗对ERα活性相关病症敏感的受试 者的方法。该方法包括确定对ERα活性相关病症敏感的受试者、使用合理 的药物设计以选择能够影响ERα活性的物质、和向受试者施用治疗有效量 的该物质。
以下，对本发明的一个或多个实施方案的细节连同附图和描述加以阐 明。本发明的其他特征、对象和优势从描述和附图、以及从权利要求中显 而易见。
附图简述
图1为带图，显示了与典型配体化合物1、化合物2或17β-雌二醇络 合的ERα二聚体结构。螺旋结构由“H2”、“H3”等表示。片层结构由S1 和S2表示。
图2显示了比较与ERα结合的17β-雌二醇和化合物1的结构的棒状 模型。
图3显示了比较与ERα结合的17β-雌二醇和化合物2的结构的棒状 模型。
图4显示了比较与ERα结合的雷洛昔芬(Raloxifene)和化合物1的结 构的棒状模型。括号表示当化合物1和雷洛昔芬结合ERα时螺旋12(H12) 的位置。
图5显示了对应于载体、17α-乙炔基雌二醇(EE)或化合物2的子宫重 量(mg)比较图。
图6显示了人ERα受体的氨基酸序列(SEQIDNO：1)。用于结晶的序 列(ERα配体结合结构域)通过下划线表示。
在多个附图中同样的指示符号表示同样的元素。
发明详述
通过X射线晶体学确定与各种非甾体类激素化合物1(IUPAC名称： 4-[1-烯丙基-7-(三氟甲基)-1H-吲唑-3-基]苯-1，3-二醇)和化合物2(IUPAC名 称：4-[(8-氟-6-甲基菲啶-5(6H)-基)磺酰基]苯酚)结合的人雌激素受体α配 体结合结构域(ERα-LBD)的结构，并描述于此处。图1为说明与代表性配 体化合物1、化合物2或天然受体配体17β-雌二醇(E2)络合的ERα二聚体 的结构的带状图。图2和3为棒状图，其分别将与ERα-LBD结合的化合 物1和化合物2和与ERα-LBD结合的E2的结构进行比较。该带状和棒状 图显示与ERα-LBD结合的化合物1或化合物2的三级结构和与ERα-LBD 结合的E2的三级结构相似。因此认为，人ERα-LBD/化合物1复合体和 人ERα-LBD/化合物2复合体的晶体结构(分别见以下表9和10)对于设计 和鉴定也可以与ERα-LBD结合的其它配体，例如，非甾体类配体是有用 的。
给出化合物1的化学结构为：

给出化合物2的化学结构为：

与E2相似，化合物1和化合物2能够结合ERα并且抑制核因子-κB (NFκB)诱导的炎症事件。然而，与E2不同，化合物1或化合物2与ERα 的结合不刺激雌性化效果。例如，施用化合物1或化合物2不刺激子宫或 乳房组织的增殖。
一般而言，可以如所需制备结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD 复合体。在某些实施方案中，可如下制备此类复合体。从DNA质粒表达 人ERα-LBD。该表达受启动子，如诱导型启动子驱动。可以将人ERα-LBD 表达为具有合适标记的稠合蛋白，所述标记为例如谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)、myc、HA、六聚组氨酸或FLAG标记。该标记有助于将人ERα-LBD 从细胞中分离。可以在引入稠合蛋白的蛋白酶位点处切割稠合蛋白，例如 在多肽和标记之间的稠合位点处或其附近。在切割和纯化后，可将人 ERα-LBD与化合物1或化合物2接触。例如，人ERα-LBD可在纯化前(例 如在切割多肽标记之前)或纯化后与化合物1或化合物2混合。在某些实施 方案中，可以在纯化前将化合物1或化合物2与人ERα-LBD混合后纯化。 在某些实施方案中，可以在缺少配体的情况下评估人ERα-LBD的结构。
可以将人ERα-LBD与化合物1或化合物2在溶液中组合，以获取人 ERα-LBD/化合物1复合体或人ERα-LBD/化合物2复合体的光谱数据、这 两种复合体任一的NMR数据、或者用于使这两种复合体任一的晶体生长。 例如，可以在盐(如钠盐)、聚合物(如聚乙二醇(PEG))和/或有机溶剂的存在 下，结晶人ERα-LBD/化合物1复合体或人ERα-LBD/化合物2复合体。 可以通过多种方法生长晶体，例如座滴或悬滴蒸发扩散法(sittingor hangingdropvapordiffusion)。一般而言，可在从约4℃至约60℃下进行 结晶(例如从约4℃至约45℃，如在约4℃、约15℃、约18℃、约20℃、 约25℃、约30℃、约32℃、约35℃、约37℃)。
一般而言，结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD晶体能够衍射X 射线至分辨率至约3.5或更小(例如约3.2或更小、约3.0或更小、约 2.5或更小、约2.4或更小、约2.3或更小、约2.2或更小、约2.1 或更小、约2.0或更小、约1.9或更小、约1.8或更小、约1.7或更 小、约1.6或更小、约1.5或更小、约1.4或更小)。在某些实施方案 中，结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD晶体能够衍射X射线至分辨 率为从约1.7至约2.5(例如结合化合物1的ERα-LBD晶体能够衍射X 射线至约2.4)。
在一个实施方案中，结合化合物1的人ERα-LBD晶体属于空间群C2， 晶胞参数为a＝104.80，b＝54.12，c＝97.10，且α＝γ＝90°，β＝113.67°。 在另一实施方案中，结合化合物2的人ERα-LBD晶体属于空间群C2，晶 胞参数为a＝104.80，b＝54.12，c＝97.10，且α＝γ＝90°，β＝113.67。 空间群指晶体的整体对称性，并且包括点对称和空间对称。在某些实施方 案中，结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD晶体能够在不对称单元中 含有两分子人ERα-LBD。不对称单元是最小的单元，可以通过利用空间 群的对称操作从其产生晶体结构。晶体通常由不对称单元的空间群对称操 作限定的基序和通过晶格对基序的翻译构成。
可以通过如X射线衍射获取描述晶体的结构数据。可以通过多种射线 源、X射线波长和检测器采集X射线衍射数据。在某些实施方案中，可以 使用旋转阳极和同步加速器源(如高级光源(ALS)，Berkeley，California；或 高级光子源(APS)，Argonne，Illinois)作为X射线源。在某些实施方案中， 用于产生衍射数据的X射线波长可为约0.5至约1.6(如约0.7、约0.9 、约1.0、约1.1、约1.3、约1.4、约1.5或约1.6)。在某些 实施方案中，使用平面探测器和/或电荷耦合装置(CCD)作为检测器。
结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD复合体晶体的X射线衍射数 据可用于获取复合体中的原子结构坐标。这些结构坐标为Cartesian坐标， 描述原子在三维空间中相对于复合体中其他原子的位置。例如，表9和10 中列出的结构坐标分别为结合化合物1和化合物2的人ERα-LBD晶体复 合体的结构坐标。这些结构坐标描述了人ERα-LBD中原子彼此之间的位 置关系、人ERα-LBD中原子相对于化合物1或化合物2中原子的位置以 及化合物1或化合物2中原子彼此之间的位置关系。可以通过数学处理精 修复合体的结构坐标，如通过倒置或整数加或减。这样得到的结构坐标为 相对坐标。例如，描述结合化合物1或化合物2的ERα-LBD中原子位置 的结构坐标并不分别受表9和10中实际x、y和z坐标的具体限制。
结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD复合体的结构坐标可用于获 取复合体、复合体片段、ERα-LBD或ERα-LBD片段的表示(例如二维表 示或三维表示)。此类表示可用于多种应用，包括如可视化、鉴定及表征多 肽活性位点。在某些实施方案中，三维表示包括根据表9或10的人 ERα-LBD的结构坐标±衍生自氨基酸中α碳原子的不超过1.5(例如，不 超过约1.0，不超过约0.5)的均方根偏差(rms)。RMS为均值方差算术 平均值的平方根，是表示与结构坐标间偏差或变化的方式。氨基酸的保守 性置换(见下文讨论)会使产生的分子表示的结构坐标在所述均方根偏差范 围内。例如两个相互存在保守性氨基酸置换的多肽分子模型，其主链原子 坐标可位于一定rms偏差内，例如小于约1.5(例如小于约1.0，小于约 0.5)。多肽的主链原子包括α碳原子(Cα或CA)、羰基碳原子(C)以及酰 氨氮原子(N)。
多种软件程序可对结构坐标的集合进行图像表示，得到结合化合物1 或化合物2的人ERα-LBD复合体或这些复合体的片段的表示。一般而言， 此类表示应当准确反映(相对地和/或绝对地)结构坐标或来自结构坐标的信 息，如特征间的距离或角度。在某些实施方案中，该表示为二维图形，如 立体二维图形。在某些实施方案中，该表示为交互式二维显示，例如交互 式立体二维显示。交互式二维显示的实例如，能够旋转以展示多肽、多肽 片段、复合体和/或复合体片段不同面的计算机演示。在某些实施方案中， 该表示为三维表示。例如，三维模型可为分子结构的物理模型(如球棍模 型)。又例如，三维表示可以为分子结构的图像表示(例如计算机显示器上 出现的图画或图形)。当二维表示反映了三维信息时(如通过应用透视、阴 影或通过离观者近的特征阻断离观者远的特征)，二维图形表示(如图画)可 对应于三维表示。在某些实施方案中，可以在多于一个水平上建立表示的 模型。例如，如果三维表示中包括多肽如结合化合物1或化合物2的人 ERα-LBD复合体，则可在一个或多个不同结构水平上表示该多肽，如一 级结构(氨基酸序列)、二级结构(如α螺旋和β折叠)、三级结构(整体折叠)， 以及四级结构(寡聚状态)。表示可以包括不同的具体程度。例如，表示中 可包括蛋白质二级结构特征的相对位置，而不包括具体原子的位置。更为 详细的表示中可以包括如原子的位置。
在某些实施方案中，表示中可含有除了结合化合物1或化合物2的人 ERα-LBD复合体中原子结构坐标以外的信息。例如，表示可以提供有关 溶剂可进入表面的形状、模型中原子的范德瓦尔斯半径以及溶剂(如水)的 范德瓦尔斯半径的信息。其他可从表示中得到的特征包括如，静电势、大 分子结构内部空间或口袋的位置，以及氢键和盐桥的位置。
通过利用人ERα-LBD或其片段，或结合化合物1或化合物2的人 ERα-LBD复合体或其片段的表示的方法，可以鉴定或设计与人ERα-LBD 相互作用的物质。表示的实例类型包括上述表示。在某些实施方案中，表 示可以为多肽类似物、多肽片段、复合体或复合体片段。通过实施候选物 质与表示间的计算机拟合分析，可以设计或鉴定与该表示相互作用的候选 物质。一般而言，该物质为分子。物质的实例包括多肽、核酸(包括DNA 或RNA)、甾体类和非甾体类有机化合物。与多肽(如ERα多肽)相互作用 的物质能够与多肽发生暂时或稳定的相互作用。此处提及的任一种作用力 都可介导该相互作用，包括如氢键、静电力、疏水相互作用以及范德瓦尔 斯相互作用。
如上所述，X射线晶体学可用于获取结合化合物1或化合物2的人 ERα-LBD复合体的结构坐标。然而，也可利用包括NMR技术的其他技术 得到此类结构坐标。通过光谱技术(如旋光色散(ORD)、圆二色性(CD))、 同源性建模及计算机方法(如包括来自分子力学或来自动力学测定的数据 的计算机方法)可得到额外的结构信息。
在某些实施方案中，X射线衍射数据可用于构建结合化合物1或化合 物2的人ERα-LBD复合体或其片段的电子密度图，而该电子密度图可用 于得到结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD复合体或其片段的表示(例 如二维表示、三维表示)。创建电子密度图一般涉及利用有关X射线散射 相位的信息。可通过如衍射数据或增补衍射试验中提取相位信息，完成电 子密度图的构建。从X射线衍射数据中计算相位的方法包括例如多波长反 常色散(MAD)、多重同晶置换(MIR)、多重同晶置换反常色散(MIRAS)、 单重同晶置换反常色散(SIRAS)、倒易空间溶剂平滑法(reciprocalspace solventflattening)、分子置换或其任意组合。一旦确定相位，可以构建电 子密度图。通过将先前已知的多肽或先前已知的复合体(例如，含有结合配 体的多肽的复合体)的三维模型与电子密度图比对，可以使用电子密度图产 生复合体或其片段的表示。例如，可以将人ERα-LBD/化合物1复合体或 人ERα-LBD/化合物2复合体相应的电子密度图与和另一化合物，例如， 激动剂(例如，二乙基己烯雌酚(蛋白质数据库鉴定号2erd))络合的人 ERα-LBD的相应的电子密度图进行比对。在其它实施方案中，可以将人 ERα-LBD/化合物1复合体或人ERα-LBD/化合物2复合体与和天然配体 17β-雌二醇(蛋白质数据库鉴定号1a52)或拮抗剂，例如4-羟基三苯氧胺(蛋 白质数据库鉴定号3ert)络合的人ERα-LBD的相应电子密度图进行比对。
比对过程产生对比模型，其显示计算的电子密度图与已知多肽或已知 复合体模型的差异程度。然后通过一轮或多轮(例如2轮、3轮、4轮、5 轮、6轮、7轮、8轮、9轮、10轮)精修对比模型，使其更好地拟合电子 密度图。软件程序如CNS(Brunger等人，ActaCrystallogr.D54：905-921， 1998)可用于精修这一模型。可以通过如Rwork或Rfree值测量对比模型的拟 合质量。Rwork或Rfree值较小一般提示拟合度更好。可以调整对比模型中的 错误比对，提供精修的对比模型和更低的Rwork或Rfree值。这些调整可基 于人ERα-LBD、化合物1或化合物2、已知多肽和/或已知复合体的相关 信息(如序列信息)。例如，在使用已知结合配体的多肽的复合体模型的实 施方案中，调整可包括用化合物1或化合物2取代已知复合体中的配体。 又例如，在某些实施方案中，调整可包括用人ERα-LBD相应位点上的氨 基酸取代已知多肽中的氨基酸。当对精修对比模型的调整达到与电子密度 图最佳拟合时，产生的模型即为确定的描述X射线数据来源的多肽或复合 体(如ERα-LBD/化合物1复合体或ERα-LBD/化合物2复合体)的模型。此 类过程的方法公开于如Carter和Sweet编辑，“Macromolecular Crystallography”，MethodsinEnzymology，277卷，B部分，NewYork： AcademicPress，1997及其中的文章，例如Jones和Kjeldgaard， “Electron-DensityMapInterpretation”第173页，以及Kleywegt和Jones， “ModelBuildingandRefinementPractice”第208页。
以上讨论的是通过将先前已知多肽或先前已知复合体的三维模型与新 计算的与该复合体晶体对应的电子密度图进行比对得到复合体的表示的方 法。在建模过程中可以使用的调整包括用带有化合物1或化合物2取代先 前已知复合体的表示中的化合物。
可编程使机器如计算机存储结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD 复合体的结构坐标，同时还有能够在与该机器连接的显示器上产生该结构 坐标图形表示的程序。或者或此外，可设计和/或使用软件系统以接受和储 存结构坐标。该软件系统能产生结构坐标的图像表示。该软件系统也能进 入外部数据库以鉴定与人ERα-LBD具有相似结构特征的化合物(如多肽)， 和/或鉴定一种或多种候选物质，所述候选物质的特征使其可能与人 ERα-LBD相互作用。
具有含结构数据的存储器或含此类数据的软件系统的机器有助于 ERα激动剂和/或ERα拮抗剂的合理设计或选择。例如，此类机器或软件 系统有助于评估某一物质与结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD复合 体连接的能力，或有助于建模与ERα-LBD结构或序列同源性相关的化合 物或蛋白质。如这里所用，激动剂指能够模拟或增加E2的至少一种活性 的化合物，而拮抗剂指抑制E2的至少一种活性或具有与E2相反的活性的 化合物。可能一种化合物可以在一方面作为激动剂作用，而在另一方面作 为拮抗剂作用，或者一种化合物可以在一方面作为激动剂或拮抗剂作用， 而在另一方面没有作用(没有阳性或阴性作用)。例如，化合物，例如化合 物1或化合物2能够通过抑制依赖雌激素受体的NFκB诱导的炎症事件作 为ERα-LBD的激动剂起作用，并且也可以通过抑制依赖雌激素受体的雌 化事件，例如刺激乳房或子宫组织的增殖作为拮抗剂起作用。或者，化合 物，例如化合物1或化合物2可以通过模拟与ERα-LBD抑制依赖雌激素 受体的NFκB诱导的炎症事件相关的活性作为激动剂起作用(通过模拟意 指该化合物具有相同或几乎相同的活性)，并且可以对关于依赖雌激素受体 的雌化事件没有作用(没有阳性或阴性作用)。
该机器能产生结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD复合体或其片 段的表示(如二维表示、三维表示)。例如，软件系统能使机器产生此类信 息。该机器可包括机器可读的数据储存介质，其中包括用机器可读数据编 码的数据储存材料。该机器可读数据可包括结合化合物1或化合物2的人 ERα-LBD复合体或其片段的原子的结构坐标。机器可读储存介质(如数据 储存材料)包括，如常规计算机硬驱、软盘、DAT磁带、CD-ROM、DVD 以及其他磁性介质、磁光介质、光介质及适用于机器(如计算机)的其他介 质。该机器也可具有工作存储器用于储存处理机器可读数据的指令，还可 具有耦联于工作存储器及机器可读数据储存介质的中央处理器(CPU)，以 将机器可读数据处理成所需的三维表示。显示器可连接于CPU，从而可使 用户看到三维表示。因此，当与用数据使用指令编程的机器(例如加载一个 或多个此处所述程序的计算机)一同使用时，该机器能够显示此处所述的任 一多肽、多肽片段、复合体或复合体片段的图形表示(如二维图形表示、三 维图形表示)。
显示器(如计算机显示器)能够显示结合化合物1或化合物2的人 ERα-LBD复合体或这些复合体的任一片段的表示。用户能够观察该表示， 并利用来自该表示的信息建立包括化合物1或化合物2以外物质的复合体 或其片段的模型。通过如改变现有的人ERα-LBD/化合物1复合体或人 ERα-LBD/化合物1复合体的表示，可产生该模型。任选地，用户可在结 合化合物1或化合物2的人ERα-LBD的表示上添加某一物质的三维模型。 该物质可为人ERα-LBD的激动剂(如候选激动剂)或人ERα-LBD的拮抗剂 (如候选拮抗剂)。在某些实施方案中，该物质可为已知化合物或化合物片 段。在某些实施方案中，该物质可为未知的化合物或未知化合物的片段。
物质的形状需要与活性位点形状互补。在物质原子和ERα多肽原子之 间存在优选的距离或距离范围。距离长于优选距离可能伴有物质与活性位 点(例如人ERα-LBD)之间的弱相互作用。距离短于优选距离可能伴有会减 弱物质及多肽间相互作用的排斥力。当原子间距离太短时可产生空间冲突。 两个原子间过分接近会产生空间冲突，例如当两个原子间的距离短于其范 德瓦尔斯半径之和时。若存在空间冲突，用户可以调整物质与ERα多肽间 的相对位置(例如物质的刚体平移或旋转)，直至减轻空间冲突。用户可调 整物质或物质附近的ERα多肽的构象，以减轻空间冲突。也可通过改变物 质结构来消除空间冲突，例如通过将“大基团”(如芳香环)改变为较小基团 如甲基或羟基基团，或通过将刚性基团改变为能容纳不产生空间冲突的构 象的柔性基团。静电力也会影响物质与配体结合结构域之间的相互作用。 例如，静电特性可与削弱物质和ERα多肽间相互作用的排斥力相关。改变 该物质的带电量(例如通过用中性基团取代带正电基团)能够缓解静电排 斥。
在多肽/物质模型中能评价影响化合物1或化合物2与人ERα-LBD间 结合强度的作用力。这些作用力可包括如氢键、静电力、疏水相互作用、 范德瓦尔斯相互作用、偶极-偶极相互作用、π-堆积力，以及阳离子-π相互 作用。用户能可视地评价这些作用力，例如通过注意氢键供体/受体对以适 合氢键的距离和角度排列。基于该评价，用户能改变模型从而发现ERα 多肽与物质间更有利的相互作用。模型的改变可包括改变多肽的三维结构 而不改变其化学结构，如通过改变氨基酸侧链的构象或主链二面角。模型 的改变也可包括如上述改变物质的位置或构象。模型的改变还可包括改变 物质的化学结构，如通过基团的取代、添加或除去。例如，若ERα多肽上 的氢键供体位于物质的氢键供体附近，则用户可以用氢键受体替代物质上 的氢键供体。
可以调整物质和ERα多肽的相对位置或其构象，以寻找某一特定物质 与ERα多肽的最佳结合几何结构。最佳结合几何结构的特征在于，如有利 的氢键距离和角度、最大的静电吸引力、最小的静电排斥力、疏水部分与 水性环境间的隔离、及不存在空间冲突。最佳几何结构的计算能量可为 ERα多肽/物质复合体的一组可能的几何结构中最低者。可通过如分子力学 或分子动力学计算确定最佳几何结构。
可以产生一系列结合化合物1或化合物2的人ERα-LBD复合体的表 示，其中化合物1或化合物2由不同物质取代或覆盖。对于每一表示均可 计算出一个评分。该评分能描述如人ERα-LBD与物质间预期的相互作用 强度。该评分能反映上述影响结合强度的因素之一。该评分也可为反映多 于一种因素的总分。根据其评分可以对不同物质分级。
可以通过机器以自动的方式实施物质设计中的步骤。例如，可以在机 器内编程ERα-LBD的表示及候选物质的表示。机器会找到每一候选物质 与活性位点间的最佳结合几何结构，并计算出评分以确定在该系列的物质 中哪些物质有可能与人ERα-LBD相互作用最强。
可以设计和/或实现软件系统以辅助这些步骤。用于产生表示或实施最 佳分析的软件系统(如计算机程序)包括但不仅限于：来自Accelrys，Inc. (SanDiego，CA)的MCSS、Ludi、QUANTA、InsightII、Cerius2、CHARMm 和Modeler；来自TRIPOS，Inc.(St.Louis，MO)的SYBYL、Unity、FleXX 和LEAPFROG；AUTODOCK(ScrippsResearchInstitute，LaJolla，CA)、 GRID(OxfordUniversity，Oxford，UK)；DOCK(UniversityofCalifornia， SanFrancisco，CA)；以及Flo+和Flo99(Thistlesoft，MorrisTownship， NJ)。其他有用的程序包括来自OpeneyeScientificSoftware(SantaFe，NM) 的ROCS、ZAP、FRED、Vida和Szybki；来自Schrodinger，LLC(Portland， OR)的Maestro、Macromodel和Glide；MOE(ChemicaiComputingGroup， Montreal，Quebec)、Allegrow(BostonDeNovo，Boston，MA)、CNS (Brunger等人ActaCrystall.Sect.D54：905-921，1997)以及GOLD(Jones 等人J.Mol.Biol.245：43-53，1995)。通过使用MOLSCRIPT、RASTER3D 或PyMOL(Kraulis，J.Appl.Crystallogr.24：946-950，1991；Bacon和 Anderson，J.Mol.Graph.6：219-220，1998；DeLano，ThePYMOL MolecularGraphicsSystem(2002)DeLanoScientific，SanCarlos，CA)，结 构坐标也可用于可视化ERα多肽的三维结构。
例如，该物质，可通过筛选合适的数据库选择之，可通过分析未结合 的人ERα-LBD的空间构型和电势、结合适当的软件系统从头设计之，和/ 或利用孕酮受体或其他激素受体的已知配体特性来设计。该方法可用于设 计或选择人ERα-LBD的激动剂或拮抗剂。可以设计和/或实现软件系统以 辅助数据库检索，和/或物质的选择和设计。
一旦物质得以设计或鉴定，可以获取或合成该物质并进一步评估其对 人ERα-LBD活性的作用。例如，可通过将该物质接触人ERα-LBD并测 定其对多肽活性的影响来评估该物质。评估物质的方法包括体外或体内的 活性测定。活性测定可为如基于细胞的测定。根据物质对人ERα-LBD的 作用，该物质可作为人ERα-LBD活性的激动剂或拮抗剂。也可当存在孕 酮时，使物质接触多肽以确定该物质是否抑制孕酮与多肽的结合。使含有 结合所鉴定的物质的人ERα-LBD的晶体生长，并通过X射线晶体学确定 其结构。基于第一种物质与人ERα-LBD的相互作用，可以设计或鉴定第 二物质。
多种分子分析和合理的药物设计技术进一步公开于如美国专利号 5,834,228、5,939,528和5,856,116中，以及PCT申请号PCT/US98/16879(公 布为WO99/09148)中。
虽然已描述了某些实施方案，其他实施方案也包括在内。
例如，虽然已描述了有关人ERα-LBD和化合物1或化合物2的实施 方案，更一般而言，此处的描述还针对任何雌激素受体多肽和任何具有至 少两个稠合环且至少其中之一的稠合环包括一个杂原子的配体。
雌激素受体多肽可为全长成熟多肽，其包括ERα多肽的任一同种型的 全长氨基酸序列。同种型为一级结构不同的蛋白质若干多重形式之任一。
雌激素受体多肽可以为ERα的片段，例如配体结合结构域、DNA结 合结构域、蛋白质相互作用结构域(例如活化结构域)，或其组合。
雌激素受体多肽可具有活性位点。一般而言，活性位点中可包括配体 结合位点，或磷酸化、糖基化、烷基化、酰基化或其他共价修饰位点。配 体结合位点中可包括实际结合位点邻近的额外结合位点，后者可能会与配 体相互作用而影响活性。雌激素受体多肽活性位点可包括SEQIDNO：1 的氨基酸(图6)。例如，ERα多肽活性位点可包括SEQIDNO：1中定义的 Glu353、Arg394、Phe404、Met421、Leu425和His524中的一个或多个氨 基酸。
ERα多肽的氨基酸编号可能与此处所列有所不同，ERα多肽的序列中 可含有可产生相同三维结构的某些保守性氨基酸置换。例如，ERα-LBD 的编号可以与图6中所示的有所不同，而该ERα-LBD序列中可含有保守 性氨基酸置换但仍产生与表9和10的坐标定义的相同结构并且在图1-4加 以说明。通过观察相关氨基酸序列或利用可购买的同源性软件程序(如 MODELLAR，MSI，SanDiego，CA)，很容易鉴定出其他同工型或类似 物中的相应氨基酸和保守性置换。
类似物为具有保守性氨基酸置换的多肽。保守性置换可包括将氨基酸 换为另一种与被替代氨基酸极性相似、空间排列相似、或属于同一类型(例 如疏水、酸性或碱性)的氨基酸，还包括那些在鉴定和设计与多肽(如 ERα-LBD)相互作用的物质时、以及分子置换分析和/或同源性建模中，对 ERα多肽的三维结构无重要影响的置换。
雌激素受体多肽，例如ERα多肽可能来自非哺乳动物或哺乳动物物 种。哺乳动物雌激素受体多肽例如来自人。非人哺乳动物的实例包括非人 灵长类(例如猴或猿)、小鼠、大鼠、山羊、奶牛、公牛、猪、马、绵羊、 野猪、海獭、猫和狗。非哺乳动物物种实例包括鸡、火鸡、虾、鳄和鱼。
又例如，虽然描述了以化合物1或化合物2为配体的实施方案，更一 般而言其他化合物也可用作配体。例如，无意受理论限制，基于来自晶体 复合体结构的结合化合物1的人ERα-LBD或结合化合物2的人ERα-LBD 的表示，认为：化合物1中A环的羟基与人ERα-LBD(如由SEQIDNO：1 的氨基酸位置限定)的Glu353和Arg394侧链以及存在于这两个氨基酸之 间的保守的水分子形成氢键；化合物2中A环的羟基与人ERα-LBD(如由 SEQIDNO：1的氨基酸位置限定)的Glu3534侧链以及存在于Glu353和 Arg394之间的保守的水分子形成氢键，但是不与Arg394相互作用；化合 物1和化合物2的苯基与Phe404相互作用并且有利于在ERα-LBD结合口 袋的这一区域中pi-边的堆积；化合物1和化合物2直接与ERα的His524、 Leu425和Met421相互作用；化合物1的吲唑基和化合物2的菲啶基与结 合口袋形成疏水相互作用；并且化合物1的烯丙基和化合物2的二氮杂菲 基位于ERα-LBD的结合口袋深处，位于Met421区。
无意受理论限制，基于该信息，认为能与人ERα-LBD发生一种或多 种相似的相互作用的其他化合物也能作为如人ERα-LBD的配体。此类化 合物可具有以下结构：

或

其中A、B和C代表环系统，化合物(i)的B和C为稠合环；化合物(ii)的B、 C和D为稠合环；L为接头部分，且X为取代基。化合物(i)的Y包括不超 过10个碳原子的碳链。在化合物(ii)的B/C/D环系中，环B与环C稠合， 并且环C与环D稠合，或环C和环D各自稠合于环B。
一般而言，化合物(i)和(ii)的环A、B和C以及化合物(ii)的环D各自 均由至少4个原子(如5个原子、6个原子、7个原子、8个原子、9个原子、 10个原子、11个原子、12个原子、13个原子、14个原子)独立形成。环A、 B、C和/或D中的一个或多个原子(如1个原子、2个原子、3个原子、4 个原子)可独立为杂原子(如N、S、O)。例如，在某些实施方案中，环B可 以包括一个或两个氮原子。在化合物(i)中，环B和C能够形成吲唑。在化 合物(ii)中，环B、C和D能够形成菲啶。在一些实施方案中，环A可以 是苯基、噻吩、吡咯或甲基吡咯。通常，X可以是羟基取代基、氨基取代 基、氰取代基、硝基取代基、巯基取代基、硫醇取代基、酰氨取代基或氧 取代基。X在A环的位置可以改变。例如，如果A环是苯酚，X可能在对 位或间位。第二个取代基可以发生在A环的任何位置。第二个取代基可以 是，例如羟基取代基、氨基取代基、氰取代基、硝基取代基、巯基取代基、 硫醇取代基、酰氨取代基、氧取代基或卤素(例如，氟、氯、溴、碘)。
在一些实施方案中，A环可以与另一环稠合形成双环结构。
在一些实施方案中，化合物(i)和(ii)的环A、B和C以及化合物(ii)的环 D各自独立的包括一个或多个(例如，1、2、3、4个)取代基(例如，通过氢 键、疏水相互作用和/或静电相互作用提供与人ERα-LBD偏好的相互作用 的一个或多个取代基)。而在某些实施方案中，取代基本身可以是人 ERα-LBD的氢键供体或受体，在其它的实施方案中，取代基可以通过一 个或多个可溶分子，例如水，与人ERα-LBD的部分形成氢键。
化合物(i)的B/C稠合环系以及化合物(ii)的B/C/D稠合环系能够与 ERα多肽在Met421、His524和Leu425的区域形成疏水相互作用。任选的， 该稠合环系能够与Met421直接或间接的相互作用，并且该相互作用可以 由环之一的杂原子介导，或由在环之一上的取代基介导。在化合物(i)和(ii) 的环B和C以及化合物(ii)的环D上的取代基可以是疏水的。在化合物(i) 的B/C环系的环上，且特别是在化合物(i)的环C上的取代基(Y)包括不超 过10个碳原子，且在化合物(ii)的B/C/D环系的环上的取代基包括不超过 5个碳原子。
一般而言，L可为直接的化学键，或L可由化学部分形成，例如磺酰 基部分、烷基部分、链烯基部分、炔基部分、醚部分、硫醚部分、酰氨基 部分或羰基部分。在某些实施方案中，L可由多个部分形成(例如磺酰基部 分结合烷基部分)。
认为具有上述特性的配体可以具有与化合物1或化合物2相似的生理 作用。例如，认为配体能够抑制核因子κB(NFκB)诱导的炎症事件，但是 不具有天然ERα配体17β-雌二醇的雌化作用特征。
下列实施例为说明性，而不意在作为限定。
实施例
实施例1.4-[1-烯丙基-7-(三氟甲基)-1H-吲唑-3-基]苯-1，3-二醇(化合物 1)的合成。步骤1：1-烯丙基-3-(2，4-二甲氧基苯基)-7-(三氟甲基)-1H-吲唑 的合成。
将(2-氟-3-取代-苯基)(4-甲氧基-2-取代-苯基)甲酮(1当量)、水合肼(10 当量)和DMAP(1当量)在吡啶中的溶液加热至100℃，24-48小时。使用 乙酸乙酯和1NHCl将冷却的反应混合物分开。用盐水洗涤有机相并且干 燥(Na2SO4)。将产生的残余通过快速层析纯化获得中间产物3-(4-甲氧基苯 基)-7-取代-1-1H-吲唑。
将中间产物3-(2，4-甲氧基苯基)-7-三氟甲基-1H-吲唑(0.52g，1.6mmol) 在DMF中的溶液加入氢化钠(60％于油中，0.065g，1.6mmol)。在停止 气体发生之后，加入烯丙基溴(0.138mL，1.6mmol)并且在反应周围温度 为50℃条件下搅拌过夜。使用乙酸乙酯和1NHCl分开冷却的反应化合 物。用盐水洗涤有机相并且干燥(Na2SO4)。对产生的残余使用快速层析或 HPLC色谱通过硅胶柱150×12mm(Biotage)以10mL/min使用甲基-叔丁 基醚/己烷(梯度洗脱1∶9至1∶1)纯化以获得1-烯丙基-3-(2，4-二甲氧基苯 基)-7-(三氟甲基)-1H-吲唑(0.26g)，其为白色固体。1HNMR(DMSO-d6)： δ3.73(s，3H)，3.80(s，3H)，4.85(dd，1H，J＝1.5和14.65)，5.1(m，3H)， 5.97-6.05(m，1H)，6.39(dd，1H，J＝2.32和6.14)，6.64(s，1H)，7.25(t，1H)， 7.35(d，1H)，7.85-7.87(m，2H))。
MS(ESI)m/z363[M+H]+。
步骤2：4-[1-烯丙基-7-(三氟甲基)-1H-吲唑-3-基]苯-1，3-二醇
1-烯丙基-3-(2，4-二甲氧基苯基)-7-(三氟甲基)-1H-吲唑(0.065g，0.18 mmol)于含有1.0mL的环己烯的CH2Cl2中，在-78℃用三溴化硼(0.136mL， 1.4mmol)处理，并且缓慢加热到环境温度。通过向冷却的反应中逐滴加入 CH3OH来终止反应。真空中除去溶剂并且使用乙酸乙酯和1NHCl分离 残余。用盐水洗涤有机相并且干燥(Na2SO4)。真空中除去溶剂获得粗产 物。通过结晶或使用快速层析通过水钝化的硅胶获得纯的产物。获得的 0.066g样品为白色固体。
使用下列条件获得HPLC保留时间：
柱：KeystoneAquasilC18(50×2mm，5u)，
溶剂系统：A：95％10mM乙酸铵/5％乙腈
B：95％乙腈5％10mM乙酸铵，
梯度：0％B至100％B经过0-15分钟，
流速：0.8mL/min
检测：UV(多种波长)
产物特征：
熔点：114-115℃；
1HNMR(DMSO-d6)：δ4.87(dd，1H，J＝1.37和17.10Hz)，5.31-5.08(m， 3H)，6.01-6.08(m，H)，6.39(dd，1H，J＝2.44和8.40Hz)，6.46(s，1H)，7.30(t， 1H)，3.78(d，1H)，7.85-7.87(m，1H)，8.14-8.19(m，1H)，9.59(broads，1H)， 9.82(broads，1H)
MS(ESI)m/z335[M+H]+.
对C17H13F3N2O2分析计算：C：61.08，H：3.92，N：8.38；发现：C：61.02， H：3.76，N：8.28。
实施例2.化合物1在小鼠中具有抗风湿活性
在HAECT-1细胞(永生化的人主动脉内皮细胞系)的测定中检测化合 物1。使用两种质粒转染HAECT-1细胞，一种表达人ERα基因，一种表 达报道基因，NFκB-萤光素酶。报道基因启动子包括主要组织相容复合体 I类启动子NFκB结合位点的三个拷贝。接着，用IL-1β和化合物1处理 细胞16-18小时。NFκB的转录水平直接与存在的萤光素酶的量成比例。 典型的雌激素活性表征为ER介导的基因表达和在体外缺少肌酸激酶(CK) 活性。化合物1抑制NFκB-萤光素酶报道子的表达的程度与17β-雌二醇相 似。该化合物不影响肌酸激酶水平。
典型的雌激素活性表征为在体内刺激子宫增殖。为了测定化合物1在 体内的作用，向C57BL/6小鼠施用高脂饮食5周。通过TAC-Man测定测 量NFκB靶标基因MHC、VCAM-1、RANTES和TNF-α的表达。当使用 化合物1以10或5mg/kg/天喂养小鼠5周后，全部四种基因的表达被抑制 (表1)。
表1.17α-乙炔基雌二醇和化合物1对NFκB靶标基因表达的影响。
浓度 (mg/kg/天) RANTESa (％EE)b VCAM-1a (％EE)b TNF-αa (％EE)b MHCa (％EE)b 10 41(100％) 28(100％) 42(93％) 38(84％) 5 58(100％) 38(94％) 42(96％) 38(103％) 2.5 0 0 44(92％) 0
a抑制表达的百分数
b抑制表达的百分数，与由EE以0.01mg/kg/天喂养的小鼠相比较
化合物1不引起在表1中所述的小鼠中子宫湿重的增加。
在佐剂诱导的关节炎(AIA)的疾病模型中，发现化合物1具有剂量依赖 方式的口服活性。用完全弗氏佐剂(CFA)注射鼠，并且监测在跗骨关节的 滑膜炎。在注射8天之后开始以口服化合物1两周处理小鼠。在以1或0.3 mg/kg/天施剂6天之后，跗骨关节恢复正常。0.1mg/kg/天的剂量是有活性 的，其在表2的组织记分中得以表明(又见以下表4)。
表2.口服化合物1处理两周，对佐剂诱导关节炎的动物中跗骨关节 中滑膜炎的组织记分。
剂量 (mg/kg， p.o.) 滑膜结构 (0-3) 纤维组织形 成 (0-3) 炎性细胞 (0-3) 关节翳 (0-2) 总分(0-10) 载体 2.92+/-0.21 2.67+/-0.41 2.92+/-0.3 2.00+/-0 10.50+/-0.63 1 2.08+/-0.20 1.58+/-0.38 1.33+/-0.41 0.83+/- 0.98 5.83+/-1.78 0.3 2.33+/-0.41 2.33+/-0.52 1.58+/-0.38 1.17+/- 0.75 7.42+/-1.88 0.1 2.17+/-0.68 1.92+/-0.49 1.50+/-0.45 0.83+/- 0.98 6.42+/-2.9
实施例3.4-[(8-氟-6-甲基菲啶-5(6H)-基)磺酰基]苯酚(化合物2).
步骤1：N-(4’-氟二苯基-2-基)乙酰胺
在氮气下用[1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物 (2.20g，2.69mmol)和5N氢氧化钠溶液(60mL)处理四氢呋喃(1.5L)中的 2-碘苯胺(32.6g，149mmol)和4-氟苯基硼酸(20.8g，149mmol)的搅拌溶 液。回流加热反应化合物12小时，冷却至室温，并且在真空中除去溶剂。 将残余物溶解于乙酸乙酯(250mL)并且用饱和的氯化钠水溶液(100mL)提 取。进一步使用乙酸乙酯(2×50mL)提取水相。将混合的有机相通过无水硫 酸镁干燥，过滤，并在真空中浓缩为褐色油。将该褐色油通过短的硅胶柱 过滤，并且使用乙酸乙酯-己烷的混合物(1∶4)洗脱。真空中蒸发溶剂之后， 将二氯甲烷(75mL)中的4’-氟-二苯基-2-基胺粗溶液用吡啶(27.7mL，343 mmol)、乙酸酐(15.5mL，164mmol)和4-(N，N-二甲基胺)吡啶(0.55g，4.5 mmol)处理。在室温搅拌12小时之后，使用饱和氯化铵水溶液(250mL)终 止反应。使用二氯甲烷(3×75mL)提取分离的水相，接着用0.1N盐酸溶液 (2×50mL)和饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤混合的有机相。该有机相通过无水 硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩为另一种褐色油。在加入甲苯并且将 其真空中除去(3×)之后，从乙酸乙酯-己烷结晶产生褐色固体第一次收获期 望产物(19.0g)。将母液浓缩并通过快速柱层析在硅胶上纯化，用乙酸乙酯 -己烷(1∶4)洗脱，获得第二次收获(5.0g)。
混合的收获物提供的该标题化合物为均质、无色、结晶固体(24.0g， 70％)。
熔点：123-124℃；
MS[(+ESI)，m/z]：230[M+H]+；
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ：9.24(s，1H)，7.44-7.23(m，8H)， 1.87(s，3H)；
对C14H12FNO分析计算：C，73.35；H，5.28；N，6.11。发现：C，73.09；H， 5.20；N，5.89。
步骤2：8-氟-6-甲基菲啶
将N-(4’-氟二苯基-2-基)乙酰胺(18.5g，80.7mmol)与多磷酸(250g)混 合并加热至120℃剧烈搅拌48小时。将热的反应混合物倾注于冰上并且 剧烈搅拌直至均质。加入氢氧化铵(28-30％，水溶液)直至pH大于8。过 滤白色沉淀，在乙酸乙酯(250mL)中溶解，并重新过滤。用饱和氯化钠水 溶液洗涤该混合滤液，在无水硫酸钠上干燥，过滤，并在真空中蒸发获得 褐色固体。通过从乙酸乙酯-己烷的混合物结晶纯化该褐色固体获得标题化 合物为白色、结晶固体(15.9g，94％)。
熔点：92-93℃；
MS[(+ESI)，m/z]：212[M+H]+；
1HNMR(500MHz，CDCl3)δ：8.63(dd，J＝9.0，5.4Hz，1H)，8.49(dd， J＝8.2，1.0Hz，1H)，8.10(dd，J＝8.1，1.1Hz，1H)，7.84(dd，J＝9.6，2.6Hz， 1H)，7.71(m，1H)，7.65-7.57(m，2H)，3.01(s，3H)；
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.89(dd，J＝9.1，5.6Hz，1H)，8.70 (dd，J＝8.1，1.3Hz，1H)，8.05(dd，J＝10.1，2.5Hz，1H)，7.97(dd，J＝8.1， 1.3Hz，1H)，7.80(m，1H)，7.70(m，1H)，7.63(m，1H)，3.01(s，3H)；
对C14H10FN·0.10H2O分析计算：C，78.93；H，4.83；N，6.57。发现： C，78.90；H，4.57；N，6.58。
步骤3：4-(磺酰氯)苯基乙基碳酸酯
用乙基氯甲酸酯(20.6mL，215mmol)逐滴加入处理1.25N氢氧化钠水 溶液(170mL，213mmol)中的4-羟基苯磺酸钠二水合物(50.0g，215mmol) 溶液。于室温搅拌该反应化合物12小时。冷却该化合物至0℃之后，过 滤在反应条件下形成的白色沉淀。将该固体在真空于70℃干燥。在甲苯 (350mL)中重悬该白色固体(40.0g)，并用N，N-二甲基甲酰胺(6.0mL)和亚 硫酰氯(22.0mL，298mmol)处理，产生的混合物加热至100℃12小时。 冷却至室温之后，将该反应化合物通过硅藻土过滤。真空浓缩滤液，并且 在储藏前使产生的油凝固。凝固的油溶解于乙酸乙酯-己烷(1∶4)，通过短的 硅胶柱过滤，并且真空除去溶剂以产生磺酰基氯为白色固体(34.8g，61％)。
熔点：74-76℃；
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ：7.60(d，J＝8.7Hz，2H)，7.14(d，J ＝8.8Hz，2H)，4.23(q，J＝7.1Hz，2H)，1.26(t，J＝7.1Hz，3H).
步骤4：乙基4-[(8-氟-6-甲基菲啶-5(6H)-基)磺酰基]苯基碳酸酯
使用新鲜粉碎的硼氢化钠(7.16g，189mmol)处理四氢呋喃(152mL) 中的8-氟-6-甲基菲啶(8.00g，37.9mmol)搅拌溶液。以适合控制气体发生 和放热反应条件的速率滴加三氟乙酸(11.7mL，152mmol)。在加完三氟乙 酸之后，搅拌异质的反应混合物直至反应恢复室温；接着重新回流加热14 小时。冷却至室温之后，缓慢加入饱和碳酸氢钠水溶液(250mL)。通过玻 璃棉塞过滤混合物，并使用乙醚(4×75mL)提取。将混合的有机提取物通过 无水硫酸钠干燥，过滤，并且真空浓缩提供浅褐色糊状的二氢菲啶。使用 三乙胺(31.7mL，227mmol)和4-(磺酰氯)苯基乙基碳酸酯(12.0g，45.3 mmol)处理二氯甲烷(38mL)中的二氢菲啶粗溶液，并且在室温搅拌14小 时。使用0.1N氢氧化钠溶液(150mL)终止反应并且使用二氯甲烷(6×50 mL)提取。用2N盐酸溶液(2×40mL)洗涤混合的有机提取物，经过无水 硫酸钠干燥，过滤，真空中浓缩至粘的褐色油。使用己烷(25mL)研制该褐 色油提供浅褐色固体。通过从乙酸乙酯-己烷的混合物结晶纯化该浅褐色固 体产生第一批收获的期望产物。将母液真空浓缩，通过硅胶过滤纯化，用 乙酸乙酯-己烷(1∶4)洗脱获得第二批收获物。混合的收获物提供该标题化 合物为白色结晶固体(15.2g，91％)。
熔点：136-138℃；
MS[(+ESI)，m/z]：442[M+H]+；
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ：7.77(d，J＝7.6Hz，1H)，7.63(d，J＝ 7.8Hz，1H)，7.48-7.39(m，3H)，7.19(dd，J＝9.0，2.6Hz，1H)，7.09(d，J＝ 8.7Hz，2H)，6.98(d，J＝8.7Hz，2H)，6.93(td，J＝8.7，2.6Hz，1H)，5.48(q，J ＝7.0Hz，1H)，4.21(q，J＝7.1Hz，2H)，1.25(t，J＝7.1Hz，3H)，1.15(t，J＝ 7.0Hz，3H)；
对C23H20FNO5S分析计算：C，62.57；H，4.57；N，3.17。发现：C，62.51； H，4.47；N，2.96。
步骤5：4-[(8-氟-6-甲基菲啶-5(6H)-基)磺酰基]苯酚
使用1N氢氧化钠(5.1mL)溶液处理甲醇(5.0mL)中的乙基4-[(8-氟-6- 甲基菲啶-5(6H)-基)磺酰基]苯基碳酸酯(0.45g，1.02mmol)溶液，并且加热 至75℃进行14小时。冷却至室温后，真空挥发甲醇。产生的水相混合物 用1N盐酸溶液酸化，用饱和的氯化钠水溶液(100mL)稀释，并且用二氯 甲烷(5×15mL)提取。将混合的有机相经过无水硫酸钠干燥，过滤，并且真 空浓缩为白色固体。将该固体通过短的硅胶柱纯化，使用乙酸乙酯洗脱， 提供标题化合物为均质、白色、结晶固体(0.34g，89％)。
熔点：188℃；
MS[(-ESI)，m/z]：368[M-H]-；
1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ：10.24(brs，1H)，7.76(dd，J＝7.6 Hz，1.5，1H)，7.60(dd，J＝7.8，1.4Hz，1H)，7.52(dd，J＝8.7，5.0Hz，1H)， 7.41(m，1H)，7.37(m，1H)，7.17(dd，J＝9.2，2.7Hz，1H)，6.96(td，J＝8.7， 2.7Hz，1H)，6.86(d，J＝8.9Hz，2H)，6.38(d，J＝8.9Hz，2H)，5.41(q，J＝7.0 Hz，1H)，1.13(d，J＝7.0Hz，3H)；
对C20H16FNO3S分析计算：C，65.03；H，4.37；N，3.79。发现：C，64.77； H，4.31；N，3.76。
实施例4.化合物2具有抗风湿活性
根据标准简易操作步骤养四十二只雄性，8-10周龄的路易斯大鼠。其 接受标准的食物配方和随意供应的水。每只动物由表示方案组和动物号的 笼子卡片表明身份。用不可擦拭的墨水将每只大鼠的号码标记在尾巴上。 使用完全弗氏佐剂(SigmaImmunoChemicals，St.Louis，MO)诱导关节炎。 每mL含有1mg被加热杀死并且干燥的结核分支杆菌、0.85mL矿物油和 0.15mL二缩甘露醇一油酸(批号084H8800)。
在大鼠尾根部表皮内注射0.1mL的完全弗氏佐剂。将动物随机分为7 组，每组含有6个大鼠。每组接受载体(2％吐温80、0.5％甲基纤维素)， 或化合物2混合物，以1.0mg/kg、0.3mg/kg或0.1mg/kg每天口服。在佐 剂注射之后第8天开始处理大鼠。
根据下列疾病指数每日监测关节炎严重性程度：后爪红斑、后爪肿胀、 关节触痛以及运动和姿势。使用0至3的整数级定量红斑的程度(0＝正常爪， 1＝轻度红斑，2＝中度红斑，3＝严重红斑)和肿胀(0＝正常爪，1＝后爪的轻度 肿胀，2＝后爪的中度肿胀，3＝后爪的严重肿胀)。每日的最大记分为12(表 3)。
表3.化合物2对爪肿胀的影响
天 载体 1mg/kg 0.3mg/kg 0.3mg/kg 8 11 11.3 11.5 11.3 9 11 8.8 9.8 10.7 10 11.5 7 7.3 9.3 11 11.7 6 7 9.7 12 11.7 5 6.7 10 13 11.7 1.7 3.7 4.2 14 11.7 1.3 3 3.5 15 11.7 1.3 3.7 3.5 16 11.7 1.2 2.3 3.3 17 11.7 1.2 2.3 3.3 18 11.7 1.2 2.3 3.3 19 11.7 1.2 2 3 20 11.7 1.2 2 2.8 21 11.7 1.2 1.7 2.5 22 12 1.2 1.7 2.5 23 12 1 1 1.2 24 11.7 0.8 1.3 1.3
使用AbacusConceptsSuperANOVA(AbacusConcepts，Inc.， Berkeley，CA)进行统计分析。全部目标参数用于使用邓肯新型多差距后此 测试(Duncan’snewmultiplerangeposthoctesting)进行组间方差分析。通 过平均值±标准误(SD)表达数据。并且认为如果p＜0.05，有显著性。
对于关节记分，对每种化合物的剂量应答研究的结果见于表3。在用 化合物2处理之后观察到爪红肿的下降。其似乎是剂量应答的。用载体处 理的大鼠显示严重的关节炎和爪红肿。
在研究结束时，使用CO2对大鼠实施安乐死，从尸体移取后肢并固定 于10％福尔马林缓冲液，将跗骨关节脱钙并在石蜡中包埋。用苏木精和伊 红或SaffraninO-快绿染色剂染色。
对切片编号，使检查者不清楚每组的处理情况。基于滑膜增生、炎性 细胞浸润和关节翳形成评估来自跗骨关节的滑膜组织(见表4)。使用 Mankin’s组织学分级系统评估关节软骨和骨。根据来自人髋骨关节炎(见 J.BoneJointSurg(AM)53A：152-153)评估关节软骨中的生化和代谢异 常(表5)。
表4.滑膜炎评分
类别等级
1.滑膜内衬细胞
a.无变化0
b.细胞增大，略增厚1
c.细胞增大，数目增加，中度增厚。无绒毛存在2
d.细胞增大，增厚。存在绒毛3
2.纤维组织形成
a.无变化0
b.在内衬细胞下存在纤维组织形成1
c.小面积的疏松结缔组织被纤维组织代替2
d.疏松结缔组织被纤维组织代替3
3.炎性细胞
a.偶尔可见，在选择中散布存在0
b.在内衬细胞层中或之下
和/或血管附近有小量细胞存在1
c.可能存在小病灶的细胞积聚2
d.在囊内和在内衬细胞层中或之下存在大量细胞，
经常可见大的病灶3
4.关节翳
a.未检测到0
b.可检测到关节翳1
表5.Mankin评分
类别等级
1.结构
a.正常0
b.表面不规则1
c.关节翳且表面不规则2
d.过渡区裂口3
e.放射区裂口4
f.钙化区裂口5
g.完全解体6
2.细胞
a.正常0
b.细胞过多扩散1
c.克隆形成2
d.细胞过少3
3.Safranin-O染色
a.正常0
b.少量减少1
c.中度减少2
d.严重减少3
e.没有显示的染色4
4.潮标(tidemark)完整性
a.完整0
b.被血管穿过1
如在下表6和7中所示，在使用化合物进行下列处理中观察到滑膜和 软骨记分的提高。化合物2在全部测试浓度(低至0.1mg/kg)显著全面提高 滑膜和软骨记分。这证明该化合物能够作为减缓疾病的抗风湿药物 (DMARD)起作用，其为关节炎治疗的重要成分。
表6.在来自佐剂诱导的关节炎的动物跗骨关节中对软骨改变的组织学记分(Mankin记分)，该动 物在CFA注射之后第8天开始用化合物2口服2周处理。 组 软骨结构a (0-6) 软骨细胞a (0-3) Saffranin-O/ 快绿染色a (0-4) 潮标完整 性a (0-1) 总Mankin记 分a (0-14) 载体 3.25±0.42 2.33±0.41 3.00±0 0 8.58±0.74 1mg/kg 1.25±0.27＊# 1.17±0.26＊t 2.17±0.26＊ 0 4.58±0.74＊t 0.3mg/kg 1.75±0.42＊ 1.50±0.32＊ 2.17±0.26＊ 0 5.42±0.74＊t 0.1mg/kg 2.33±0.68＊ 1.92±0.21 2.42±0.67＊ 0 6.83±1.25＊
a平均值±SD
＊sig＜载体
#sig＜化合物2，0.1mg/kg
tsig＜化合物2，0.1mg/kg
表7.在来自佐剂诱导的关节炎的动物跗骨关节中对滑膜炎的组织学记分，该动物在CFA注射 之后第8天开始用化合物2口服2周处理。 组 滑膜结构 (0-3) 纤维组织形 成a (0-3) 炎性细胞 (0-3) 关节翳 (0-2) 总滑膜炎记分 (0-10) 载体 2.92±0.21 2.67±0.41 2.92±0.21 2.00±0 10.50±0.63 1mg/kg 1.42±0.38＊# 1.33±0.41＊t 1.17±0.26＊# 0.25±0.42＊# 4.17±1.21＊#t 0.3mg/kg 1.58±0.38＊# 1.67±0.26＊t 1.25±0.27＊# 0.50±0.84＊# 5.00±1.30＊#t 0.1mg/kg 2.33±0.75 1.75±0.42＊ 1.83±0.52＊ 1.50±0.84 7.42±2.25＊
a平均值±SD
＊sig＜载体
#sig＜化合物2，0.1mg/kg
tsig＜化合物2，0.1mg/kg
在胶原诱导的关节炎模型中的评估
在6-8周龄的BALB/c小鼠中评估化合物2，在所述小鼠中由抗II 型胶原的单克隆抗体以及脂多糖(LPS)诱导关节炎。在第0天以4mg/小鼠 向静脉内施用4种不同的mAb的组合，接着在72小时后(第3天)通过静 脉内施用25mg的LPS。从第3天起，在应用LPS1小时之后，连续15 天每天口服给予测试的化合物一次。在第0、5、7、10、14和17天，使用 带有水单元(12mm直径)的器官充满度测量器测量每只动物两只后爪的体 积增加。计算对体积增加的抑制百分数。在后爪水肿有30％或更多的还原 被认为具有显著性。
在实验过程中，当以2.5mg/kg口服给药时，复合化合物2显著抑制 爪肿胀＞30％。
实施例5.化合物2不影响子宫湿重
作为证明化合物选择性的对照，在2.0％吐温80(w/v)/0.5％甲基纤维 素(w/v)的载体中以50mg/kg的浓度口服给予未成熟雌性大鼠(n＝6/处理) 化合物2。通过强饲法每天处理动物一次，进行3天。在第4天(最后给药 24小时之后)安乐死之后移取子宫，除去残余脂肪和肠系膜并称重。该化 合物的剂量(50mg/kg)为500倍高于以上实验中的有效剂量。如在图5的 图表中所示，证明化合物2不增加子宫湿重，而以1.5mg/kg(EC80)给药 的17α-乙炔基雌二醇(EE)显著刺激子宫重量。
实施例6：确定ERα-LBD/化合物1和ERα-LBD/化合物2的晶体结构。 将人ERα-LBD(图6)克隆在pET16b表达载体(Novagen，Inc.，Madison， WI)，并且在BiostatC-10生物反应器(B.BraunBiotech，Allentown，PA)中 由高密度培养的大肠杆菌BL21DE3-RP细胞(Stratagene，LaJolla，CA)过 表达该蛋白质。使用1.0mMIPTG(终浓度)在37℃诱导培养物3小时。在 液氮中快速冷冻细胞沉淀之后储存于-80℃。
在100mMTris-HClpH8.5、100mMKCl、1mMEDTA和4mMDTT 的缓冲液中重悬细胞沉淀。穿过微流体分散仪(microfluidizer)5次(Model 110Y，MicrofluidicsCorpt，Newton，Mass)使细胞悬浮液分散。在4℃离心 (13,000×g)30分钟之后，在相同的缓冲液中使用4M脲提取沉淀。离心之 后，脲提取物用于雌二醇-琼脂糖快速流式柱。首先在以上缓冲液中使用1 M脲洗柱，接着顺序使用以下洗涤：1)50mMTris-HCl，pH8.5，700mM KCl，1mMEDTA和1mMDTT；2)50mMTris-HCl，pH8.5，250mM NaSCN，1mMEDTA，和1mMDTT于10％二甲基甲酰胺；和3)10mM Tris-HCl，pH8.0。而ERα-LBD仍然结合于雌二醇-亲合柱，通过在10mM Tris-HCl，pH8.0中使用5mM碘乙酸于4℃平衡柱过夜进行羧甲基化。 使用含配体的NaSCN缓冲液洗脱羧甲基化的ERα-LBD。不同的含配体洗 脱缓冲液包括100μM17β-雌二醇、200μM化合物1或200μM化合物2。 通过SDS-PAGE确定存在与配体结合的受体。将含有结合配体的 ERα-LBD的级分汇集并且通过微孔离心超滤装置浓缩。使用以50mM碳 酸氢铵，pH7.5平衡的BioRad一次性脱盐柱对含有结合配体的ERα-LBD 的浓缩液脱盐，并用于结晶实验。
使用Hampton结晶筛选确定与配体络合的ERα-LBD的结晶条件 (HamptonResearch，AlisoViejo，CA)。在一次筛选中，将3ml蛋白质溶液 (为10mg/ml)与3ml沉淀(20％PEG3350、0.15M氯化锂、0.1MHepes， pH7.5，和4％盐酸苄脒)混合，并在18℃用1mL沉淀液平衡。3天之后 开始出现晶体并长成最大尺寸为0.3×0.2×0.08mm3。
使用量子4CCD平面检测仪在高级光源(ALS)(Berkeley，CA)下采集 分辩率数据在30.0-2.4。在-130℃采集数据并且使用DENZO和 SCALEPACK加工(Otwinowski和Minor，MethodsEnzymol.276：307-326， 1997)。ERα/化合物1和ERα/化合物2共结晶都属于每个不对称单元带有 两个分子的空间群C2。
在使用AmoRe(Navaza，ActaCrystallogr.A50：157-163，1994)的旋转 和翻译的研究中，使用来自2erd.pdb(Shiau等人，Cell95：927-37，1998)的 二聚体模型定位ERα分子。使用分辩率从30至2.4的全部数据通过CNS (Brunger等人，ActaCrystallogr.D54：905-921，1998)进行结构精修。在两 种结构中，使用3Fo-2Fc和Fo-Fc电子密度图鉴定配体位置和螺旋12位置。 在几轮重建、最小化和个体B因子精修之后，将Rwork和Rfree因子汇聚 为ERα/化合物1复合体结构为24.1％和27.5％，ERα/化合物2复合体结 构为26.7％和30.5％。最终模型含有两个拷贝的蛋白质(残基307-546中 的333-340，459-471和528-535残基由于无序而被省略)、两个配体和水分 子。表8概括了数据收集参数和结果。

表8.化合物1和化合物2的数据采集的X-射线衍射统计 d
数据采集：

晶系 单斜晶系 空间群 C2 单位晶胞大小 化合物1：A＝104.803，b＝54.124，c＝97.102， α＝γ＝90°，β＝113.668° 化合物2：A＝105.128，b＝52.927，c＝95.534， α＝γ＝90°，β＝113.247° 数据采集温度 -130℃ 晶体数 1 放射源 量子4CCD平面检测仪，于ALS(Berkeley，CA) X-射线波长 1.0 数据的分辨率范围 30.0-2.4 最大分辩率 2.4 Rmerge a 化合物1：9.0％；化合物2：7.7％ 完全性 化合物1：98.7％；化合物2：99.4％ 总反射 化合物1：70450 化合物2：68760 唯一反射 化合物1：19,668 化合物2：19,085 I/σ(I) 化合物1：14.49 化合物2：16.69
相位与精修
分子精修模型 2erd.pdb(ERα-LBD/二乙基己烯雌酚) 构建体(氨基酸) ERα-LBD(301-554) 化合物(配体) 化合物1和化合物2 每个不对称单元的ERα-LBD分子数 2 精修分辩率范围 30.0-2.4 Rwork 化合物1：24.1％ 化合物2：26.7％ Rfree 化合物1：27.5％ 化合物2：30.5％ 非氢蛋白质原子数(在二聚体结构中) 化合物1：3281 化合物2：3309 水分子数 化合物1：161；化合物2：225 理想键长的RMS偏离 化合物1：0.0085；化合物2：0.0099 理想键角的RMS偏离 化合物1：1.313；化合物2：1.371 aRmerge＝|Ih-